2xTaq ultra PCR Mix 藍(lán)色（含染料）

產(chǎn)品貨號(hào)：T0214

存儲(chǔ)條件：-20℃

2xTaq ultra PCR Mix 藍(lán)色（含染料）

產(chǎn)品說(shuō)明

2x Taq Ultra PCR mix 的濃度為 2x，使用方便快捷，能減少 PCR操作過(guò)程中的污染，使用時(shí)只需取適量2x Taq Ultra PCR mix(藍(lán)色染料)，加入模板和引物，并加入ddH2O 補(bǔ)足體積，使反應(yīng)體系濃度為 1x，即可進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。PCR 產(chǎn)物 3'端帶突出A堿基，純化后可直接用于 T/A 克隆。

本產(chǎn)品中含有 Taq DNA 聚合酶和一種含有 3'→5'外切活性的蛋白，能夠高效擴(kuò)增≤7 kb 的 DNA 片段，擴(kuò)增產(chǎn)量高，配合優(yōu)化后的反應(yīng)緩沖液，可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同 GC 含量(30%~70%)的高效擴(kuò)增。此外相較于普通Taq PCR Mix 延伸速度提高了 2~4 倍，可有效縮短反應(yīng)時(shí)間。

本PCR Mix中包含兩種染料，PCR產(chǎn)物無(wú)需添加 Loading Buffer可直接點(diǎn)樣電泳，且電泳過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色和紅色兩個(gè)指示條帶。該染料不影響 PCR 擴(kuò)增效率，但對(duì)于需要對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行吸光度、熒光等光學(xué)分析的實(shí)驗(yàn)，建議在分析前對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

質(zhì)量控制

核酸內(nèi)切酶活性檢測(cè)

將25 μl 2x Taq ultra PCR Mix與 200 ng 超螺旋質(zhì)粒 DNA 配制成 50 μl 反應(yīng)體系，在37°C下，共同溫育4h后，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，少于 10% 的質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)變成缺刻或線性狀態(tài)。

非特異性核酸酶活性檢測(cè)

將25 μl 2x Taq Ultra PCR Mix與 15 ng 雙鏈 DNA 片段配制成 50 μl反應(yīng)體系，在 37℃下溫育 16 h，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)雙鏈 DNA 底物無(wú)變化。

使用方法

1.常規(guī) PCR 反應(yīng)體系 ( 冰上操作 )

a. 需融解完quan后使用，防止離子濃度不均勻；

b. 引物推薦終濃度為0.2~0.4 μM，效果不佳時(shí)可以在 0.1~1 μM 濃度范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整；

c. 不同模板最佳反應(yīng)濃度有所不同，以 50 μl 體系為例：模板為基因組 DNA 時(shí)一般推薦的使用量為 10~200 ng；當(dāng)模板為質(zhì)粒或病毒 DNA 時(shí)，一般推薦的使用量為 10 pg~5 ng。模板量過(guò)多時(shí)容易造成非特異性擴(kuò)增。

2. 三步法 PCR 反應(yīng)程序

3. 二步法 PCR 反應(yīng)程序

d. 菌落 PCR 時(shí)預(yù)變性 10 min，可充分破壁細(xì)胞，大腸桿菌或酵母菌均可高效擴(kuò)增。

e. 退火溫度請(qǐng)根據(jù)引物 Tm 值設(shè)置。如果需要，推薦通過(guò)建立溫度梯度尋找引物與模板結(jié)合的最適溫度。此外，退火溫度直接決定擴(kuò)增特異性，如發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增特異性差，可適當(dāng)提高退火溫度。

f. 目的片段長(zhǎng)度< 3 kb，延伸時(shí)間可縮短至 15 s/kb；目的片段長(zhǎng)度>3 kb，延伸時(shí)間建議 30 s/kb。若要達(dá)到最佳擴(kuò)增效果或較高產(chǎn)量，推薦統(tǒng)一使用 30s/kb 速度延伸。 

注意事項(xiàng)

一、引物設(shè)計(jì)

1. 引物 3' 端最后一個(gè)堿基最好為 G 或者 C。

2. 引物 3' 端最后8個(gè)堿基應(yīng)避免出現(xiàn)連續(xù)錯(cuò)配，同時(shí)也避免出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

3. 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不超過(guò) 1℃為佳，Tm值調(diào)整至 55~65°C為佳(引物Tm值推薦使用 Primer Premier5進(jìn)行計(jì)算)。

4. 引物額外附加序列，即與模板非配對(duì)序列，不應(yīng)參與引物 Tm 值計(jì)算；引物的 GC 含量控制在 40%~60% 之間。

5. 引物 A、G、C、T整體分布要盡量均勻，避免使用 GC 或者 AT 含量高的區(qū)域。

6. 引物內(nèi)部或者兩條引物之間避免有5個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列，兩條引物的 3'端避免有3個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列。

7. 引物設(shè)計(jì)完畢請(qǐng)使用 NCBI BLAST 功能檢索引物特異性，以避免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。

二. 產(chǎn)物電泳與染色

建議使用泡染法進(jìn)行電泳后染色，膠染法會(huì)導(dǎo)致紅色指示條帶發(fā)生彌散，不利于條帶指示，對(duì)藍(lán)色指示條帶無(wú)影響。藍(lán)色條帶在 1% TAE 緩沖液中遷移速率約等于 1500 bp，紅色條帶在 1% TAE 緩沖液中遷移速率約等于 100 bp。