(N30210-1L)Ni NTA Beads 6FF(鎳填料)

貨號：N30210

存儲條件：4-30℃

1、純化流程

1.1 Buffer 的準(zhǔn)備

Buffer 可使用下列推薦Buffer，也可根據(jù)自己的使用習(xí)慣配置不同的緩沖液體系，基本原理就是低咪唑上樣，高咪唑洗脫，或者高pH上樣，低pH洗脫。Buffer 在使用前最好用0.22μm 或者0.45μm濾膜過濾除菌。因?yàn)镹i NTABeads FF可以用于可溶蛋白和包涵體蛋白的純化，兩種方法所需Buffer 不同，具體配置方法見下表：

(N30210-1L)Ni NTA Beads 6FF(鎳填料)可溶性組an酸標(biāo)簽蛋白純化所需緩沖液及配方:

包涵體組an酸標(biāo)簽蛋白純化所需緩沖液及配方：

1.2樣品準(zhǔn)備

1.2.1細(xì)菌或酵母表達(dá)的蛋白

1、挑取單菌落到LB 培養(yǎng)基中，根據(jù)載體使用說明加入相應(yīng)濃度的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)相應(yīng)的時(shí)間。

2、表達(dá)結(jié)束后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心杯中，7,000rpm，離心15min 收集菌體，然后加入1/10 體積的 Lysis Buffer 和 PMSF，PMSF在破碎前加入，最終濃度為1mM。加入溶jun酶（工作濃度為0.2-0.4mg/ml，如果表達(dá)的宿主細(xì)胞內(nèi)含pLysS 或pLysE，可以不加溶jun酶），（同時(shí)也可加入其他蛋白酶抑制劑，但不能影響目的蛋白與樹脂的結(jié)合）。

3、將菌體沉淀懸浮起來，（如果菌液濃度高，也可考慮加入10μg/ml RNase A 和5μg/ml DNase I），混勻，放置于冰上，然后冰上超聲破碎細(xì)胞，至菌液基本保持澄清。

4、將澄清的破碎液轉(zhuǎn)移至離心管中，10,000rpm 下，4 度離心 20-30 分鐘。取上清，置于冰上備用或-20度保存。

1.2.2酵母、昆蟲和哺乳細(xì)胞分泌表達(dá)可溶性蛋白

1、將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心杯，5000rpm 下，離心10min，收集菌體得上清，如上清中不含EDTA、組an酸和還原劑等物質(zhì)，即可直接加入柱子使用；如含有EDTA、組an酸和還原劑等物質(zhì)，需用1×PBS 4℃下透析才能加入柱子。

2、對于大量體積的上清，需加入硫酸氨沉淀濃縮后，蛋白還需用1XPBS 4℃透析后才能加入柱子。

1.2.3包涵體蛋白純化(變性條件)

1、將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心杯中，7,000rpm，離心15min 收集菌體，去掉上清。

2、按照菌體：Lysis buffer=1:10(W/V)將菌體懸浮起來，混勻，冰浴超聲破碎。

3、將破碎液轉(zhuǎn)移至離心管中，10,000rpm下，4 度離心20-30 分鐘。去掉上清，步驟2）和 3）可以重復(fù)一次。

4、按照菌體:Lysis buffer(含8M 尿素)=1:10(W/V)將包涵體懸浮起來。

5、變性條件下進(jìn)行His 標(biāo)簽蛋白純化，具體緩沖液配方見表4。

1.3Ni NTABeads 6FF 的裝填

Ni NTA Beads 6FF 被廣泛應(yīng)用于工業(yè)純化，因此，涉及到各種中壓色譜層析柱的填裝，下面介紹使用 Ni NTA Beads 6FF 填裝層析柱的方法。

層析柱的裝填（使用儲液器裝填）

1、用去離子水沖洗層析柱底篩板與接頭，確保柱底篩板上無氣泡，關(guān)閉柱底出口，并在柱底部留出1-2cm 的去離子水。

2、將樹脂懸浮起來，小心的將漿液連續(xù)地倒入層析柱中。用玻璃棒沿著柱壁倒入漿液可減少氣泡的產(chǎn)生。

3、如果使用儲液器，應(yīng)立即在層析柱和儲液器中加滿水，將進(jìn)樣分配器放置于漿液表面，連接至泵上，避免在分配器或進(jìn)樣管中產(chǎn)生氣泡。

4、打開層析柱底部出口，開起泵，使其在設(shè)定的流速下進(jìn)行。最初應(yīng)讓緩沖液緩慢流過層析柱，然后緩慢增加至最終流速，這樣可避免液壓對所形成柱床的沖擊，也可以避免柱床形成的不均勻。如果達(dá)不到推薦的壓力或流速，可以用你所使用泵的最大流速，這樣也可以得到一個很好的裝填效果。（注意：在隨后的色譜程序中，不要超過最大裝柱流速的75%）當(dāng)柱床高度穩(wěn)定后，在最后的裝柱流速下至少再上3倍柱床體積的去離子水。標(biāo)上柱床高度。

5、關(guān)閉泵，關(guān)閉層析柱出口。

6、如果使用儲液器，去除儲液器，將分配器至于層析柱中。

7、將分配器推向柱子至標(biāo)記的柱床高度處。允許裝柱液進(jìn)入分配器，鎖緊分配器接頭。

8、將裝填好的層析柱連接至泵或色譜系統(tǒng)中，開始平衡。如果需要可以重新調(diào)整分配器。

1.4樣品純化

Ni NTA Beads 6FF裝填好后，可以用各種常規(guī)的中壓色譜系統(tǒng)，以ÄKTA 儀器使用為例介紹其使用方法。

1、將泵管道中注滿去離子水。去掉上塞子，將層析柱連接至色譜系統(tǒng)中，打開下出口，將預(yù)裝柱接到色譜系統(tǒng)中，并旋緊。

2、用3-5 倍柱體積的去離子水沖洗出儲存緩沖液。

3、使用至少5 倍柱床體積的Lysis Buffer 平衡色譜柱。

4、利用泵或注射器上樣。注：樣品的粘度增加使得即使上樣體積很少，也會導(dǎo)致層析柱很大的反壓。上樣量不要超過柱子的結(jié)合能力。大量的樣品體積也可能造成很大的反壓，使得進(jìn)樣器更難使用。

5、用Wash Buffer 沖洗柱子，直到紫外吸收達(dá)到一個穩(wěn)定的基線（一般至少10-15個柱體積）。注：在樣品和結(jié)合緩沖液中加入咪唑可以提高樣品純度。

6、用Elution Buffer 采用一步法或線性梯度洗脫。一步洗脫中，通常 5 倍柱體積洗脫液就足夠了。可以用一個小的梯度，例如 20 倍柱體積或更多，來分離不同結(jié)合強(qiáng)度的蛋白質(zhì)。

1.5SDS-PAGE 檢測

將使用純化產(chǎn)品得到的樣品（包括流出組分、洗雜組分和洗脫組分）以及原始樣品使用SDS-PAGE 檢測純化效果。

2、在位清洗

當(dāng)填料使用過程中發(fā)現(xiàn)反壓過高或者填料上面出現(xiàn)明顯的污染時(shí)，需要進(jìn)行在位清洗操作（Cleaning-in-Place，CIP）。在位清洗前，先把 Ni2+脫掉（參見3.填料再生），清洗結(jié)束后，將填料保存在 20%乙醇中，后者重新掛鎳再保存在20%乙醇中。建議按照下面操作去除填料上殘留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

去除強(qiáng)疏水結(jié)合的蛋白，脂蛋白和脂類

通過使用30%異丙醇清洗 5-10 個柱體積，接觸時(shí)間為15-20分鐘可以去除此類污染物。然后，再使用 10 倍柱體積的去離子水清洗。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或堿性溶液， 清洗填料 2 倍柱體積。例如，含有 0.1–0.5% 非離子去污劑的 0.1 M 醋酸溶液，接觸時(shí)間為 1–2 小時(shí)。去污劑處理后，需要使用70%的乙醇清洗 5 個柱體積，以徹di去除去污劑。最后使用10倍柱體積的去離子水清洗。

去除離子作用結(jié)合的蛋白

使用1.5M NaCl 溶液接觸時(shí)間為10-15分鐘清洗。然后再使用去離子水清洗10個柱體積。

3、填料再生

組an酸標(biāo)簽蛋白親和純化填料所帶的鎳離子不需要經(jīng)常螯合去除和重新掛鎳離子。當(dāng)填料使用過程中發(fā)現(xiàn)反壓過高，填料上面出現(xiàn)明顯的污染，或者填料載量明顯變低時(shí)，需要進(jìn)行對填料進(jìn)行鎳離子剝離和重新掛鎳離子，也就是填料再生。將填料裝填在合適的層析柱內(nèi)，按照下面操作流程進(jìn)行鎳離子剝離和重新掛鎳離子。

3.1使用0.2 M 醋酸溶液（含6 M GuHCl）清洗 2 倍柱體積；

3.2使用去離子水清洗5 倍柱體積；

3.3使用2% SDS 清洗 3 倍柱體積；

3.4使用去離子水清洗5 倍柱體積；

3.5使用乙醇清洗5 倍柱體積；

3.6使用去離子水清洗5 倍柱體積；

3.7使用100 mM EDTA (pH 8.0)清洗 5 倍柱體積；

3.8使用去離子水清洗5 倍柱體積；

3.9使用100 mM NiSO4 清洗 5 倍柱體積；

3.10使用去離子水清洗10 倍柱體積；

填料再生后，可以立即使用，也可以保存在20%的乙醇中，置于 4°C 保存。