在分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)研究中，免疫共沉淀 (Co-IP)和免疫沉淀 (IP)實(shí)驗(yàn)是探索蛋白 質(zhì)相互作用、驗(yàn)證靶蛋白結(jié)合關(guān)系的關(guān)鍵技術(shù)。無論是研究信號(hào)通路、蛋白復(fù)合物，還是疾病相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)，IP/Co-IP 都能提供直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，幫助科學(xué)家深入解析生命活動(dòng)的分子機(jī)制。本期內(nèi)容將系統(tǒng)梳理IP/Co-IP 實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)步驟以及如何分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

一、實(shí)驗(yàn)原理

免疫沉淀/免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)的方法。 在免疫沉淀中，通過特定抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合，形成抗體—抗原復(fù)合物，再利用沉淀的方法將其 從混合物中分離出來，從而純化目標(biāo)蛋白。而免疫共沉淀可以檢測(cè)兩個(gè)已知蛋白之間的相互作用。當(dāng)用預(yù)先固化在beads上的蛋白質(zhì)A 的抗體免疫沉淀A 蛋白，那么與A 蛋白在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)B 也能一起沉淀下來。

①用proteinA/G連接抗體，然后用抗體去抓目的蛋白

②beads上已經(jīng)偶聯(lián)了標(biāo)簽抗體，可以直接抓目的蛋白

二、實(shí)驗(yàn)流程

樣品制備

植物樣本：分成小塊后用液氮研磨粉碎，然后加入裂解液(加蛋白酶抑制劑)冰上/借助超聲裂解合適 的時(shí)間，離心取上清。

動(dòng)物細(xì)胞：棄去培養(yǎng)基，用PBS 洗幾次，然后加入裂解液(加蛋白酶抑制劑)冰上裂解合適的時(shí)間， 離心取上清。

動(dòng)物組織：剪碎后加入裂解液(加蛋白酶抑制劑),然后用勻漿器勻漿，裂解充分后離心取上清。

平衡beads

用TBS 等緩沖液或者裂解液清洗beads3-5 次，將beads 中的保護(hù)液替換成實(shí)驗(yàn)中緩沖液體系，避免影 響下游實(shí)驗(yàn)。

孵育

方法一：抗體和磁珠先孵育

選擇經(jīng)過IP驗(yàn)證的抗體，可以減少失敗的可能性，此外抗體的用量也較為重要，抗體用量過少不 利于后續(xù)抗原結(jié)合，而抗體過多就不能完quan吸附在beads 上，造成浪費(fèi)，一般建議抗體使量為 2-5ug  即可?？贵w和beads 室溫孵育30-60min 或4℃孵育1-2h后，吸棄上清，加入裂解后的樣品共孵育。

注：若使用已經(jīng)偶聯(lián)好標(biāo)簽抗體的beads，則可以直接和裂解好的樣品孵育，不用偶聯(lián)抗體。

方法二：抗體和抗原先孵育

抗體和抗原先進(jìn)行孵育，然后抗體抗原復(fù)合物與beads進(jìn)行孵育。

洗雜

用裂解液或PBS 洗滌沉淀，2500rpm (約1000g)離心5min, 或瞬時(shí)高速離心，小心吸除上清，重復(fù)此 步驟3-5次。這一步是為了洗去未結(jié)合的雜蛋白。