實(shí)驗原理

實(shí)驗步驟

一、樣本制備

1.樣本收集

①貼壁細(xì)胞收集：吸出培養(yǎng)基，向培養(yǎng)皿中加入預(yù)冷的1×PBS，漂洗2次，利用細(xì)胞刮或胰酶消化收集貼壁細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管，離心收集細(xì)胞沉淀。

②懸浮細(xì)胞收集：先離心收集細(xì)胞沉淀，再用預(yù)冷 PBS 輕輕吹打重懸，然后離心收集細(xì)胞沉淀。

③動物組織樣本收集：在冰上用干凈的醫(yī)用剪將組織剪成小塊。然后在液氮中將組織研磨粉碎。

④植物樣本收集：取適量植物組織樣本（葉片等）放置于冷凍液氮中，之后將冷凍后的植物組織放于研缽進(jìn)行研磨，盡可能充分研磨破壞其細(xì)胞壁。

2.總蛋白提取

①細(xì)胞/組織裂解：

細(xì)胞樣本，加入預(yù)冷的裂解緩沖液(含有 PMSF/蛋白酶抑制劑)，冰上裂解 15min。

組織樣本，按照 1mL 裂解液/100mg 組織向勻漿器中加入蛋白裂解液，多次勻漿，直至組織完quan勻漿，收集勻漿液。

②把裂解好的樣本12000rpm離心10min，取上清用于后續(xù)實(shí)驗。

③蛋白變性：

吸取 10μl 蛋白上清做蛋白濃度（BCA 法）測定。向剩余的蛋白提取液中加 5× Loading Buffer（最終工作液為 1x)，95℃加熱變性 10min，待液體完quan冷卻后置于-20℃分裝保存，避免反復(fù)凍融。

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二、蛋白濃度測定 

1.BCA法

測定原理：在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu²⁺絡(luò)合并將Cu²⁺還原成Cu⁺。BCA與Cu⁺結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562 nm處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測定蛋白質(zhì)濃度。

特點(diǎn)：靈敏度高，操作簡單，試劑及其形成的紫藍(lán)色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳，并且受干擾物質(zhì)影響小，不受去垢劑的影響。

2.Bradford法

測定原理：在酸性條件下考馬斯亮藍(lán)(Coomassie brilliant blue G-250)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，染料的最大吸收峰由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色由棕色變?yōu)樗{(lán)色，形成的復(fù)合物顏色的深淺與蛋白濃度的高低成正比關(guān)系，因此可以在595 nm波長下測定吸光度值從而計算蛋白含量。

特點(diǎn)：操作簡單，對EDTA、EGTA等還原劑兼容性好，但易受強(qiáng)堿性和高濃度去污劑影響。

3.Lowry法

測定原理：堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物此絡(luò)合物將Folin試劑還原，產(chǎn)生深藍(lán)色，顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。

特點(diǎn)：不受脂類物質(zhì)干擾，也能耐受相當(dāng)濃度的去垢劑如SDS。

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三、凝膠電泳

五、封閉

1. 將膜取出后，應(yīng)觀察到marker完quan從膠轉(zhuǎn)移至膜上。

2. 用TBST清洗掉膜上殘留的轉(zhuǎn)膜液，每次5-10分鐘，洗3-5次。

3. 將PVDF膜浸泡在5% 脫脂牛奶中，緩慢搖蕩，室溫孵育1h。

注：除脫脂牛奶，封閉也可以用BSA或者商品化的封閉液。

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六、抗體孵育

1. 孵育一抗：封閉結(jié)束后，用1xTBST緩沖液洗掉多余封閉液，洗膜每次5-10min，共3-5次。一抗使用一抗稀釋液或TBST按照抗體說明書建議的比例稀釋(具體條件自行摸索)使用，然后將膜浸泡在一抗中，于4℃冰箱中搖床孵育過夜，一抗孵育后可以回收。

2. 孵育二抗：用1xTBST緩沖液洗掉多余一抗，洗膜每次5-10min，洗3-5次。使用5%脫脂牛奶或商品化抗體稀釋液按照說明書推薦比例稀釋二抗，室溫慢搖1h。

3. 洗膜：二抗孵育完畢后，回收二抗，用1xTBST洗膜，每次5-10min，洗3-5次。

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七、曝光

1. 配置顯影液(A液:B液=1:1)，避光。

2. 顯影液滴于PVDF膜上，孵育1-3min。

3. 孵育結(jié)束后，垂直吸取多余發(fā)光液，蛋白面朝上置于儀器中，可裁剪錫箔紙遮光。

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