IP/COIP常見(jiàn)問(wèn)題

1、設(shè)置實(shí)驗(yàn)對(duì)照

陽(yáng)性對(duì)照：input, 即裂解后的上清，判斷目的蛋白是否表達(dá)。

陰性對(duì)照：和ip抗體同型的IgG。

2、抗體、樣本、beads的加入順序

①抗體先與蛋白結(jié)合，再加入beads;

②抗體先與beads 孵育，最后加入蛋白；

③ 抗體、樣本和beads 同時(shí)加入。

一般情況下①和②相差不大，如果蛋白量過(guò)高，比如大于1000ug,建議 使用第二種，否則蛋白容易吸附在磁珠上，降低得率。

3、beads磁珠和瓊脂糖珠如何選擇

瓊脂糖珠：需要離心，操作繁瑣；吸走上清時(shí)容易吸走樣品。

磁珠：無(wú)需離心，縮短操作時(shí)間；磁珠吸到管壁，不易被吸走樣。

4、如何避免輕重鏈污染

產(chǎn)生輕重鏈的原因：在變性洗脫過(guò)程中，抗體在高溫和還原劑的影響 下分解為重鏈55KD 和輕鏈25KD, 當(dāng)WB 所用的抗體和IP抗體同源時(shí)，二抗就會(huì)識(shí)別到IP抗體的輕重鏈。

避免方法：

①IP抗體和WB 一抗選用不同來(lái)源的。

②二抗采用Fc抗體或者Fab 抗體避開(kāi)輕鏈或重鏈。

③選擇偶聯(lián)納米抗體的beads。

5、input組有條帶 ，IP組無(wú)條帶

①確定使用的抗體是否可以用來(lái)做IP,盡量選擇可以做IP的抗體。

②IP抗體加入的量少， IP抗體特異性差，或者蛋白量過(guò)高，優(yōu)先覆蓋 住beads,  導(dǎo) 致IP抗體和beads 的結(jié)合較少等，可以優(yōu)先通過(guò)增加抗 體用量和優(yōu)化結(jié)合順序改善，實(shí)在沒(méi)有改善只能更換抗體進(jìn)行嘗試。

6、input組沒(méi)有條帶 ，IP組有條帶

input 組沒(méi)有條帶可能是因?yàn)榈鞍妆磉_(dá)量較低，而IP組經(jīng)過(guò)富集后蛋 白含量較高，所以可以檢測(cè)到?？梢蕴岣遡nput 組的上樣量或者在提 蛋白時(shí)提高樣本量。

7、IgG 組及IP 組均檢測(cè)到目的條帶

原因：

①檢測(cè)蛋白與beads 有非特異性結(jié)合。

②洗滌不充分，有殘留蛋白。

 解決辦法：

①使用封閉劑(如5%BSA)  預(yù)處理磁珠。

②增加洗滌次數(shù)或提高洗雜液的鹽濃度。