EMSA/Gel-Shift 試劑盒化學發(fā)光法

貨號：EM001

存儲條件：1-4組分-20℃保存，其他組分可4oC保存，一年有效。

產(chǎn)品組分

產(chǎn)品簡介：

本試劑盒基于電泳遷移率變動實驗（EMSA/Gel-Shift），結(jié)合化學發(fā)光檢測技術(shù)，用于快速、高靈敏度地檢測蛋白質(zhì)與核酸（DNA/RNA）的特異性相互作用，如轉(zhuǎn)錄因子、核酸結(jié)合蛋白等的結(jié)合活性分析。試劑盒包含EMSA檢測所需要的結(jié)合緩沖液，適用于基礎研究、藥物篩選及分子機制研究。

自備試劑

1. 探針

2. 提取用蛋白裂解液

3. 蛋白酶抑制劑

4. 帶正電荷的尼龍膜或NC膜

5. EMSA電泳相關試劑

EMSA/Gel-Shift 試劑盒化學發(fā)光法

操作步驟（供參考）：

1. 樣品制備

（1）蛋白提取

a. 細胞樣本：

收集1x107細胞，加入1ml 1xPBS洗滌一次，1000rpm離心5 min 去除上清，收集細胞；加入預冷裂解液1ml，同時按比例添加蛋白酶抑制劑，重懸細胞，劇烈渦旋10秒充分混勻，置于冰上30分鐘，可每10分鐘充分吹打一次；4℃，12000-16000g離心15分鐘，將裂解產(chǎn)物（上清）轉(zhuǎn)移到一個新的預冷管中，丟棄沉淀。

b. 動物組織：

將0.1g的組織切成非常細小的碎片，在冰浴條件下充分勻漿，用100um的細胞篩等收集細胞懸液，可加1xPBS沖洗；

4℃，1500g離心5min，棄上清收集細胞沉淀；沉淀中添加預冷的裂解液200ul（需添加蛋白酶抑制劑）可額外添加10ul DTT，重懸細胞后，劇烈渦旋10秒充分混勻，置于冰上30分鐘，可每10分鐘充分吹打一次；

4℃，12000-16000g離心15分鐘，將裂解產(chǎn)物（上清）轉(zhuǎn)移到一個新的預冷管中，丟棄沉淀。

c. 植物組織和不易勻漿的動物組織：

去植物樣本約0.2g，液氮研磨；加入500-1000ul 預冷的裂解液（添加蛋白酶抑制劑）進行裂解，為了提高裂解效率，可加入 200ul 玻璃粉（可選）按照600-800g離心力充分震蕩 30min，裂解完成后 12000 rpm，離心30min，吸取上清置于新的離心管中，棄去沉淀。

d. 原核/真核表達蛋白：

誘導蛋白表達并鑒定表達形式，要求表達的蛋白為上清表達；純化誘導表達的蛋白；

e. 考馬斯亮藍或BCA測定蛋白樣本濃度；

f. 樣本分裝為約40ul/管，保證每管含有5-25ug蛋白，液氮速凍后-80℃保存。

注意：避免反復凍融蛋白，分裝保存于 -80°C。

(2) 探針標記

使用生wu素或熒光標記的 DNA/RNA 探針。

注意：探針需退火形成雙鏈，避免核酸酶污染。

2. 結(jié)合反應

(1) 反應體系配制

根據(jù)以下表格配置不同組別的EMSA反應：

(2) 反應條件

按照以上順序添加各試劑，加入未標記的探針或者抗體后混勻，并在PCR儀上37℃反應20min，讓冷探針和抗體優(yōu)先反應；

加入標記好的探針混勻，在PCR儀上37℃反應20min。

注：a.避免劇烈震蕩，防止復合物解離。

b.如需做super-shift反應需自備抗體

c.若蛋白為原核表達，經(jīng)純化后每個反應體系終含量為：25ng-75ng

d.競爭性探針野生型和突變型的使用量均為生wu素標記探針的50-200倍

3. DNA-EMSA非變性凝膠電泳配置

(1) 按照以下比例配置5% 非變性 PAGE 膠，總體積10ml（可按比例擴大）

依照上述次序依次加入各溶液，添加TEMED茜需混勻，添加TEMED后需要立即混勻并灌膠。灌膠時避免氣泡并添加梳齒。

注：如發(fā)現(xiàn)制膠時很容易出現(xiàn)氣泡，怎可對制膠玻璃板進行硅烷化處理。

(2) 上樣與電泳

每孔加入 1 μL 10X 上樣緩沖液（無色） 混合樣品后進行上揚。

注：有些樣品會受溴酚藍影響，建議盡量使用無色的上樣緩沖液

上樣時在多余的上樣孔中加入10ul稀釋后的1x上樣緩沖液 (藍色)用于觀察電泳進行的情況。

電泳條件：

電壓：100 V（恒壓），建議按照10V/cm進行電泳

緩沖液：0.5X TBE緩沖液

時間：電泳至溴酚藍遷移至距離膠底部1/4處。

注：低溫電泳（4°C）可減少復合物解離，建議在電泳過程中觀察電泳溫度，確保溫度不超過30℃，如果溫度升高需要適當降低電泳電壓；

4. 轉(zhuǎn)膜與檢測

(1) 轉(zhuǎn)膜（尼龍膜/硝酸纖維素膜）

a. 取一張和EMSA膠大小相近的尼龍膜或NC膜，剪刀剪角做好標記，用0.5X TBE buffer浸泡10min以上；

注：尼龍膜或者NC膜請勿用手接觸，全程用鑷子夾取，且不能接觸樣品位置

b. 取2張轉(zhuǎn)印用濾紙，用0.5X TBE buffer 浸泡，濾紙大小與上面轉(zhuǎn)印膜的大小相近或者略大

c. 將浸泡過的膜置于浸濕的濾紙上，小心的取出EMSA膠放置于膜上；

d. 建議用濕轉(zhuǎn)的方式進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件：100 mA 恒流（或約390mA），4°C 轉(zhuǎn)膜約60 min（緩沖液：0.5X TBE）。

e. 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用鑷子小心取出膜，樣品面向上，放置于干燥的濾紙上，輕輕吹掉表面比較明顯的液體。立即進入交聯(lián)（步驟(2)）步驟。

注：

a. 轉(zhuǎn)膜時間建議在30-60 min，如膠比較厚則應當適當延長轉(zhuǎn)膜時間；

b. 結(jié)合膜的表面一定不能干燥!

c. 采用半干轉(zhuǎn)膜儀建議按照390mA，30min。

(2) 交聯(lián)

a. 利用紫外交聯(lián)時建議交聯(lián)條件為：120 mJ/cm2，選擇紫外波長254nm，45-60s。

如無紫外交聯(lián)儀可以使用普通的手提紫外燈進行交聯(lián)，在距離膜3-375px的位置照3-15min，最佳交聯(lián)條件需要根據(jù)標準品咨詢過摸索；

b. 交聯(lián)完成后進行檢測，也可用保鮮膜包裹膜后置于室溫干燥條件存放，可存放3-5天再進行檢測。

(3) 封閉與孵育抗體

a. 封閉：取封閉液 (P1203) 15ml，加入適當容器中（如抗體孵育盒），再加入交聯(lián)后的尼龍膜或者PVDF膜 室溫搖育 15min。

注：確保封閉液是完quan溶解的狀態(tài)再使用。

b. 取7.5ul Streptavidin-HRP稀釋于15ml 封閉液（按照1:2000稀釋），將封閉后的膜加入封閉液中，置于搖床（水平或者側(cè)擺皆可）室溫孵育15 min。

注：Streptavidin-HRP稀釋液可以重復使用3-4次，建議保存于-20℃，1月內(nèi)使用完。

c. 洗滌：將5X 洗滌液25ml用蒸餾水或者milli Q稀釋至 1X （稀釋后體積25ml），取稀釋后的洗滌液20ml洗膜，洗膜4 次（每次 5 min）。

d. 將膜轉(zhuǎn)至含有20-25ml 檢測平衡液的孵育盒中，在搖床上緩慢搖動5 min。

(4) ECL 顯色

a. 取ECL發(fā)光液A液和B液各5ml按 1:1 混合 ECL A/B 液制成發(fā)光工作液。

注：發(fā)光液必須現(xiàn)用現(xiàn)配。

b. 將檢測平衡液中的膜取出用吸水紙吸掉過多液體，置于保鮮膜或者干凈的容器內(nèi)，在膜表面添加發(fā)光工作液至覆蓋全部的膜，室溫靜置2-3 min；

c. 將膜放于2片保鮮膜或者其他適當透光薄膜中間病故定于壓片暗盒內(nèi)部，用X光膠片壓片1-5 min，顯影定影，或者直接用化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)中掃描成像。

三、注意事項

1、探針設計時要確保探針包含蛋白結(jié)合位點，長度建議 20-40 bp。

2、本產(chǎn)品僅限專業(yè)人員用于科學研究，不得用于臨床診斷或治療。

3、為了您的安全和健康，請佩戴一次性手套進行操作。