G418 (Geneticin) 遺傳霉素

產(chǎn)品貨號：G4180

儲存溫度：常溫運輸。-20℃避光保存，有效期 3 年。避免受潮，否則會降低抗生素活力。

產(chǎn)品描述

G418是一種結(jié)構(gòu)類似于慶da霉素 B1（Gentamycin B1）的氨基糖苷類抗生素，在分子遺傳試驗中，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染zui常用的抗性篩選試劑，。它通過抑制轉(zhuǎn)座子 Tn601，Tn5 的基因，干擾核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成， 對原核和真核等細胞產(chǎn)生毒素，包括細菌、酵母、植物和哺乳動物細胞 ,也包括 原生動物和蠕蟲。當抗性基因neo被整合進真核細胞基因組后 , ,則能啟動neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為 mRNA，從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達，此酶通過共價修飾 G418 的氨基或羥基功能，抑制抗生素-核糖體間的相互作用，從而使得抗生素失活。這一特性賦予細胞產(chǎn)生抗性。穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株篩選實驗，需要建立殺滅曲線（劑量反應曲線）確定殺死無抗性細胞的最di有效濃度。植物細胞中，通過轉(zhuǎn)染攜帶 nptII 基因的抗性質(zhì)粒孵育其抗性。nptII 基因也能編碼表達氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，這個酶使 得多種抗生素喪失活性，包括 G418，卡na霉素和ba龍霉素。

產(chǎn)品性質(zhì)

英文別名（English synonym）	Antibiotic G418; G418 Sulfate
中文別名（Chinese Synonym）	G418 硫酸鹽；遺傳霉素
CAS號（CAS NO.）	108321-42-2
分子式（Formula）	C20H40N4O10·2 H2SO4
分子量（Molecular weight）	692.7 g/mol
外觀（Appearance）	白色粉末
純度（Purity）	>700Ug/mg
溶解性（Solubility）	溶于水
結(jié)構(gòu)式（Structure）

使用方法

1. G418 儲存液的配制（50 mg/mL，活性濃度）

1）活力單位的換算 根據(jù)此公式進行換算：（1000/A0）×A1=A2，其中 A0是 G418 的

活力值（Potency），因批次而異?？梢娕螌馁|(zhì)檢報告， 或者瓶子上的標簽。A1 是想配制的活性 G418 濃度。A2 是實際稱重的粉末與體積比濃度。 比如若所用批次的 G418

活力值為：750 U/mg，要配制 50 mg/mL 的 G418 活性濃度，則實際要配制的粉末濃度為 1000/750×50 mg/mL=66.33 mg/mL。 如果配制 10 mL 的 G418 儲存液（活性濃度，50 mg/mL），則需要稱取 663.3 mg 粉末。

2）除菌和保存 根據(jù)上述換算得到的實際粉末稱重量，加入 10 mL 無菌去離子水內(nèi)使其wan全溶解。 先用 5 mL 無菌去離子水預濕潤 0.22 μm 針頭式過濾器，除盡水。之后使用此濾器過濾，除菌后分裝成單次使用的小量（如 1mL）放到-20℃凍存，1 年穩(wěn)定。                                                                  

【注】①不要對混濁的溶液進行過濾，因為混濁的溶液意味著未wan全溶解，過濾過程中會造成藥物損失，降低終液的活性。 ②不建議使用液體培養(yǎng)基，NaCl，磷酸鹽溶液或者有機溶劑來制備儲存液。

2. 常用篩選濃度

一般來說，剛開始篩選轉(zhuǎn)化子需要高濃度的 G418，并用一個較低濃度的 G418 用于維持培養(yǎng)。生長條件，細胞類型和其他 的環(huán)境因素都可能影響 G418 的用量，因此第一次使用的實驗體系建議通過殺滅曲線（kill curve），即劑量反應性曲線，來確 定最佳篩選濃度。 通常情況，哺乳動物細胞篩選范圍 200-2000 μg/mL；植物細胞：10-100 μg/mL；酵母細胞：500-1000 μg/mL；

以下是一些細胞類型使用 G418 篩選使用的濃度，可做參考。

3.殺滅曲線的建立

【注】為了篩選得到穩(wěn)定表達目的蛋白的細胞株，需要確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細胞的抗生素最di濃度，可通過建立殺滅曲 線（劑量反應曲線）來實現(xiàn)，至少選擇 6 個濃度。處理分裂期的細胞時 G418 的活性最qiang，因此在添加 G418 之前需 要讓細胞培養(yǎng)一段時間。

1）第一天：未轉(zhuǎn)化的細胞按照 20-25%的細胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO2 培養(yǎng)過夜；

【注】對于需要更高密度來檢測活力的細胞，可增加接種量。

2）根據(jù)細胞類型，設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度。以哺乳動物細胞為例，可設(shè)定 0，50，100，200，400，800，1000 μg/mL。

3）第二天：去除舊的培養(yǎng)基，換用新鮮配制的含有相應濃度藥物的培養(yǎng)基。每個濃度做三個平行孔。

4）接下來每 3-4 天更換新的含藥物培養(yǎng)基。

5）按照固定的周期（如每 2 天）進行活細胞計數(shù)來確定阻止未轉(zhuǎn)染細胞生長的恰當濃度。選擇在理想的天數(shù)（通常是 7-10 天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細胞的最di濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞篩選用的工作濃度。

4. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的篩選

1）轉(zhuǎn)染 48 h 后，用含有適當濃度的 G418 篩選培養(yǎng)基來傳代細胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。

【注】細胞處于活躍分裂狀態(tài)時抗生素的殺傷效果zui 好。則當細胞過于稠密，其效率會降低。為了得到j(luò)iao好的篩選效guo，最 好將細胞稀釋至豐度不超過 25%。

2）每隔 3-4 天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。

3）篩選 7 天后觀察并評估細胞克?。洌┑男纬汕闆r。集落的形成可能還需要一周或者更多的時間，這取決于宿主細胞 類型，轉(zhuǎn)染，以及篩選效果。

4）挑取并轉(zhuǎn)移 5-10 個抗性克隆于 35 mm 細胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng) 7 天。

5）之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。

注意事項

1）本品不可高壓滅菌；

2）G418不要和其他的抗生素/抗真菌劑（如qing霉素/lian霉素）共同使用，因為它們是G418的競爭性抑制劑。其他的抗生素也 會產(chǎn)生交叉活性。

3）配制G418溶液時，一定要根據(jù)G418批次不同的活力值（potency）來進行換算，從而得到需要活性濃度的儲存液以及工作液。

4）G418加入培養(yǎng)體系中未轉(zhuǎn)染的細胞有可能不會被殺死，原因在于藥物濃度過低，或者細胞密度過高。另外，快速分裂的細胞相對于緩慢增殖細胞，更容易被殺死。對照細胞（未轉(zhuǎn)染）可能抗生素添加5-7天后才能殺死，轉(zhuǎn)染細胞（抗性克隆子）的克隆需要10-14天形成。

5）即使加入殺死劑量的G418，細胞可能會繼續(xù)分裂2-3次。G418的藥效通常在2天后才變得明顯。

6）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。