LabpO TOPO-TA/Blunt通用克隆試劑盒

產(chǎn)品貨號(hào)：PT0101

儲(chǔ)存溫度：－20℃儲(chǔ)存，至少12個(gè)月。冰袋運(yùn)輸，1-2 天置于室外常溫不影響質(zhì)量。

產(chǎn)品介紹

本制品和傳統(tǒng)的T4連接酶原理不同，它利用了Topoisomerase可以在瞬間（幾秒鐘-幾min）、高效（接近100%）連接DNA片段的原理采用本公司du創(chuàng)的工藝制成。

（1）可以在瞬間（幾秒鐘-幾min）完成任意PCR產(chǎn)物（兼容A末端/平末端）連接。

（2）特制的新型載體質(zhì)粒大小僅僅不到2kb，充分發(fā)揮了TOPO載體越小，可容納片段越大的優(yōu)勢，最大限度提高了大片段連接效率；連接后質(zhì)粒大小比傳統(tǒng)載體小2kb以上，質(zhì)粒越小，轉(zhuǎn)化效率越高，極大的提高了各種片段連接后的轉(zhuǎn)化子數(shù)量。

（3）采用氨芐抗性載體只需10min復(fù)蘇時(shí)間，比卡那抗性載體1小時(shí)復(fù)蘇時(shí)間縮短6倍。

（4）最快可以不用冰浴和熱休克，室溫5min內(nèi)完成轉(zhuǎn)化；無需1小時(shí)復(fù)蘇，只需37℃10 min復(fù)蘇便可以涂板。從連接到涂板最快只需15-20min。

（5）zi殺基因零背景原理，無自連假陽性，無需繁瑣藍(lán)白斑篩選和菌落PCR篩選。大部分情況下隨機(jī)挑一個(gè)克隆便是有插入的（接近100%）。

（6）連接長片段能力遠(yuǎn)超傳統(tǒng)TA/Blunt克隆載體，可連接長達(dá)10kb片段（例如連接5kb片段，也可能達(dá)到挑10個(gè)菌落，至少8個(gè)是有插入的效果），是新一代shi界領(lǐng)xian的簡單、快速、零背景免篩選的TOPO TA/Blunt克隆載體。

注意：測序只能采用M13F/M13R通用引物測序（見后面圖譜），但是不能采用M13(-47)/M13(-48)通用引物測序。菌落 PCR 可使用和測序相同的引物。

操作步驟

1.連接反應(yīng)的準(zhǔn)備：

PCR引物使用正常設(shè)計(jì)的引物即可，不需做任何改變（不能用磷酸化引物）。任意PCR產(chǎn)物（兼容A末端/平末端）均可以直接連接。PCR產(chǎn)物一般建議膠回收純化，這樣可以避免后續(xù)可能的問題。如果PCR產(chǎn)物僅有目的條帶、無非特異條帶和引物二聚體，也可嘗試直接進(jìn)行連接反應(yīng)。如果是以質(zhì)粒為模板的PCR產(chǎn)物則最好進(jìn)行純化，因?yàn)槟０遒|(zhì)粒也可能長出菌落（但不是想構(gòu)建的目的載體）。

2.連接反應(yīng)：

1）室溫（25℃-37℃）設(shè)立10ul連接體系（建議用0.2ml PCR 管，PCR儀器控溫）：

加完試劑后，用移液器輕輕吹打混勻或者輕彈管底混勻，低速瞬時(shí)離心收集所有液體在離心管底，注意此步驟不能在冰上進(jìn)行，只能在室溫（25℃-37℃）進(jìn)行。

注：如果使用5ul體系連接，各成分按照比例減半使用，使用次數(shù)可以加倍。不同大小插入片段的推薦用量（注意過量太多了，反而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子減少）

2）室溫（25℃-37℃）連接5min。

本載體推薦室溫（25℃-37℃）5min完成連接。長片段或者連接困難片段可以延長連接時(shí)間到10-15min，溫度可選37℃，可顯著增加轉(zhuǎn)化子數(shù)量。

3）連接產(chǎn)物置于冰上備用。立即接標(biāo)準(zhǔn)的感受態(tài)轉(zhuǎn)化步驟或者快速轉(zhuǎn)化步驟。

3.快速轉(zhuǎn)化：

1）感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰浴中，解凍融化（約1-3min左右）。

2）立刻加入5ul連接液(最多可全部加入，只要體積不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10)， 用手撥da離心管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰浴放置5min。

3）42℃水浴熱激60秒，迅速放回冰浴靜置2-3min，該過程不要搖動(dòng)離心管。

注意：此步驟shou選建議 42℃水浴 60 秒熱激。但是根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，大部分商品化的TOP 10 和 DH5a 感受態(tài)細(xì)胞此步驟也可將離心管置于室溫（?22℃）進(jìn)行， 時(shí)間不需十分準(zhǔn)確，夏季或室溫較高時(shí)，可放置 5-8min左右；如果室溫較低，可延長時(shí)間至8-15min左右。有經(jīng)驗(yàn)的客戶可以根據(jù)具體情況嘗試無熱激轉(zhuǎn)化。

4）加 300-500ul LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃ 200 rpm 振蕩培養(yǎng)10min。

根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，一般可以直接將培養(yǎng)基（如從冰箱取出溫度低，應(yīng)事先置37℃溫箱回溫至22℃-37℃）加入到感受態(tài)細(xì)胞的1.5 ml 離心管，蓋上離心管蓋，水平固定在振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)復(fù)蘇即可，不需要轉(zhuǎn)移到試管培養(yǎng)復(fù)蘇。

一般商品化的感受態(tài)細(xì)胞不超過 2kb 插入片段情況下，熱休克后 10-15 min復(fù)蘇可以得到足夠多轉(zhuǎn)化子，如果使用實(shí)驗(yàn)室自制的感受態(tài)效率低、或者轉(zhuǎn)化子少、插入片段長的情況下可以提高復(fù)蘇時(shí)間到 30-60 min以得到更多的轉(zhuǎn)化子。

5）取100-200ul菌液涂板(培養(yǎng)板含氨芐qing霉素100ug/ml），培養(yǎng)過夜。（如果預(yù)計(jì)轉(zhuǎn)化子少，為得到較多克隆，4000rpm 離心1min，吸棄掉部分上清，保留100-150ul，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）

4.轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定：

本制品采用zi殺基因零背景原理，無插入自連的細(xì)菌會(huì)zi殺無法生長，因此幾乎沒有假陽性，一般情況下，可以達(dá)到所見即所得，只要是長出來的菌落正常（不是污染的雜菌，轉(zhuǎn)化子數(shù)量也不算太少），基本就包含插入。因此插入片段不超過 2-3kb 的情況下可以不用菌落PCR 鑒定,直接挑 1-2 個(gè)菌去測序。

1)一般本公司TOPO 載體陽性率非常高，所以菌落生長正常，數(shù)量也不是太少的情況下建議省略菌落 PCR/菌液 PCR 鑒定直接去測序。注意測序引物不能采用M13(-47)/M13(-48)通用引物測序。

2) TOPO 載體的菌落 PCR 結(jié)果容易出現(xiàn)假陰性。因此在使用菌落 PCR 鑒定的情況下，如菌落 PCR 結(jié)果陽性，一般可以相信此結(jié)果。如結(jié)果是陰性，或者顯示擴(kuò)增出大小和預(yù)期不符合，一般不可相信，要考慮到菌落 PCR 結(jié)果假陰性的可能。需要進(jìn)一步提取質(zhì)粒電泳跑大小，或者酶切鑒定來確認(rèn)。

用上述培養(yǎng)的白色菌落的菌液抽提質(zhì)粒，插入片段較大的情況下，直接跑電泳看質(zhì)粒大小就直接能鑒定出有插入的質(zhì)粒，還可用 EcoR I/Ecor V 單酶切釋放插入片段或用其它合適的酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小，確定是否含有目的片段。

pTOPO-TA/Blunt 載體圖譜：

pTOPO-TA/Blunt 載體多克隆位點(diǎn)序列：