【干貨分享】Western實(shí)驗(yàn)步驟及產(chǎn)品選擇

Western blot，也稱Western blotting、Western印跡，常簡(jiǎn)寫(xiě)為WB，是用抗體檢測(cè)蛋白表達(dá)的重要方法之一。WB步驟操作如下：

一、 收集蛋白樣品(Protein sample preparation)

1、裂解液的選擇

根據(jù)蛋白在細(xì)胞中的位置選擇合適的裂解液，例如RIPA強(qiáng)(R1091)用于核蛋白及膜蛋白的提取、RIPA中（R1090）用于胞漿蛋白的提取、而RIPA弱或者western專用裂解液（W0013）適用于較好提取的蛋白；

對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提

2、抑制蛋白降解

為防止蛋白的降解，需要添加蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑等。例如LABLEAD的蛋白酶抑制劑cocktail（C0101）是一種廣譜型的抑制劑，由六種成分配置成的溶液，可適用于蛋白純化，western，IP等各種實(shí)驗(yàn)。

如研究磷酸化蛋白，為保持蛋白的穩(wěn)定，可使用磷酸蛋白酶酶抑制劑（C0104）。

3、蛋白定量：

收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y(cè)定方法。不同的蛋白濃度測(cè)定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。

如果使用LABLEAD的裂解液(R1091、R1090、W0013)，可使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(B5001)、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(去垢劑兼容型)(B5106)。

如自己配置裂解液，其中含有triton x-100、SDS等去污劑時(shí)，推薦使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(B5001)；如溶液中含有EDTA、DTT等還原劑時(shí)推薦使用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒（B5105）

二、電泳(Electrophoresis)

1、SDS-PAGE凝膠配制

SDS-PAGE凝膠分幾種配置的方式，如需自行配置可購(gòu)買(mǎi)制膠液，如30%制膠液（A3291）、4*SDS濃縮膠緩沖液（S4880）、4*SDS分離膠緩沖液（S4680），也可使用LABLEAD生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(P1050M)、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(P0105)。兩種試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。

如需更方便的電泳，可使用LABLEAD的各種濃度規(guī)格的預(yù)制膠產(chǎn)品(P00812/P00815/P01012/P01015/P01212/P01215/P41212/P41215/P42012/P42015)。

2、樣品處理

在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如4X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制，推薦LABLEAD的蛋白上樣緩沖液(4X)(G2526)或 蛋白上樣緩沖液(5X) (G2527)。

如果是非變性樣品，可以使用非變性非還原性蛋白上樣緩沖液(G2621)。

樣品處理時(shí)可按照100℃或沸水浴加熱3-5min，或者95℃ 加熱10min，以充分變性蛋白。如使用預(yù)制膠，可適當(dāng)延長(zhǎng)樣品處理的時(shí)間。

3、上樣與電泳

蛋白樣品冷卻到室溫后，直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。

LABLEAD提供各種預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)用于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小。最好使用彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(P1017/P1018/P1025/P10310)。

電泳液推薦使用蘭博利德生產(chǎn)的SDS-PAGE電泳液(T7777)，或者可以長(zhǎng)期儲(chǔ)存的速溶顆粒產(chǎn)品（T7206M）。

電泳時(shí)推薦在上層膠時(shí)使用低電壓恒壓電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳。對(duì)于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在80-100V，高電壓可以設(shè)置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求。為了方便起見(jiàn)，也可以采用整個(gè)SDS-PAGE過(guò)程恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在100V，然后設(shè)定定時(shí)時(shí)間為90-120分鐘。設(shè)置定時(shí)可避免發(fā)生電泳過(guò)頭的情況。

當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，或可根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。

三、 轉(zhuǎn)膜(Transfer)

推薦在Western實(shí)驗(yàn)中選用PVDF膜，優(yōu)先推薦使用PVDF膜，如蛋白分子量大于20KD推薦使用(進(jìn)口分裝，13.25*15cm,0.45μm) (IPVH00010-1)，蛋白分子量小于20KD推薦使用(進(jìn)口分裝，13.25*15cm,0.45μm) (ISEQ00010-1)。PVDF膜在使用前須經(jīng)甲醇浸潤(rùn)和活化。也可使用硝酸纖維素膜(NC膜)，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過(guò)程中特別是用鑷子夾取等過(guò)程中容易裂開(kāi)。

轉(zhuǎn)膜推薦使用bio-rad的預(yù)裁轉(zhuǎn)印濾紙(7.5×10cm) (cat：1703932)，吸水性強(qiáng)，不掉屑。

轉(zhuǎn)膜溶液推薦使用LABLEAD的10X轉(zhuǎn)膜緩沖液(T3011)，需要在稀釋是添加20%的甲醇，以提高轉(zhuǎn)膜效率。出于安全性、省事性的考慮LABLEAD還有使用乙醇配置的轉(zhuǎn)膜緩沖液，20x快速轉(zhuǎn)膜緩沖液（T3012）

通常濕式轉(zhuǎn)膜方式，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過(guò)夜。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。

如使用伯樂(lè)的Turbo系統(tǒng)進(jìn)行半干轉(zhuǎn)時(shí)，在使用伯樂(lè)配套的轉(zhuǎn)膜緩沖液（）時(shí)，則可參考以下轉(zhuǎn)膜條件：2.5A恒流，限壓25V，3-5min即可完成轉(zhuǎn)膜。

在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí)，通常會(huì)有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，最好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

轉(zhuǎn)膜的效果可參考所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，其中分子量最大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液對(duì)膜進(jìn)行染色，用于觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也可用免脫色考馬斯亮藍(lán)快速染色液(G1042)對(duì)完成轉(zhuǎn)膜的蛋白膠進(jìn)行染色，用于檢測(cè)轉(zhuǎn)膜的效果。

四、封閉(Blocking)

轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將蛋白膜放置到預(yù)先加入了清水的孵育盒（FYH01-1）中，漂洗1-2分鐘，洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后的所有步驟，要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則很容易產(chǎn)生較高的背景。

倒掉洗膜后的液體，推薦加入適量的快速封閉液(P0203)，在搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉20-30分鐘；也可以加入用脫脂奶粉（N7861）配置的5%的溶液作為封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉60分鐘或者4度過(guò)夜。對(duì)于一些背景較高的抗體，兩種封閉液都可以適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間，如有必要甚至可以4℃封閉過(guò)夜。

五、一抗孵育(Primary antibody incubation)

參考一抗的說(shuō)明書(shū)，按照適當(dāng)比例用一抗稀釋液(D0151)稀釋一抗。一抗也可以用TBST溶液或者配置好的封閉液稀釋，但是為了延長(zhǎng)一抗的使用時(shí)間，推薦用一抗稀釋液。

收集封閉液，然后加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳，可以4℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜。也可根據(jù)抗體的說(shuō)明選擇適當(dāng)?shù)姆跤郎囟群蜁r(shí)間。

回收一抗。加入TBST緩沖液(T9039)洗去未結(jié)合的一抗，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。

Western結(jié)果通常需要提供內(nèi)參作為對(duì)照，可以選用Tubulin抗體(T0100)、Actin抗體(A0101)或GAPDH抗體(G0100)，進(jìn)行內(nèi)參檢測(cè)。

六、二抗孵育(Secondary antibody incubation)

參考二抗的說(shuō)明書(shū)選擇辣根過(guò)氧化物酶(HRP)等標(biāo)記的二抗。二抗需根據(jù)一抗進(jìn)行選擇，例如，一抗是小鼠來(lái)源的IgG，則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗，如山羊抗小鼠IgG-HRP(H+L)(S0100)。

加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。

回收二抗，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘，重復(fù)洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。

七、顯影檢測(cè)

使用LABLEAD ECL發(fā)光液來(lái)檢測(cè)蛋白，ECL發(fā)光液 普通款（E1050）一般使用暗室曝光時(shí)可推薦此款。如需更靈敏的發(fā)光液，推薦使用 ECL 超敏發(fā)光液（E1060），和 ECL 超敏發(fā)光液M（E1070，和millipore WBKLS0100同級(jí)別）；如蛋白豐度極低時(shí)推薦使用 ECL超敏發(fā)光液(femto)（E1080）。

八、膜的重復(fù)利用

如果蛋白樣品很寶貴，可使用膜再生液(M0500)處理蛋白膜，以重復(fù)利用蛋白膜。再次重生使用的膜需要重新封閉后孵育新的二抗。