貨號(hào)：B1013/4/5/6

存儲(chǔ)條件：-20℃儲(chǔ)存，組分 A需避光，避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品組分：

產(chǎn)品介紹

細(xì)胞凋亡的一個(gè)顯著特點(diǎn)是細(xì)胞染色體 DNA 的降解， 這種降解非常特異并有規(guī)律，所產(chǎn)生的不同長(zhǎng)度的DNA片段為180 bp-200 bp的整數(shù)倍，表現(xiàn)為瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)特異的梯狀Ladder圖譜。本試劑盒采用 TUNEL 法，應(yīng)用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）在凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3′-OH末端催化摻入 YF®/Cy-dUTP，YF®/Cy-dUTP 標(biāo)記的 DNA 可以用熒光顯微鏡直接觀察或者用流式細(xì)胞儀定量。TUNEL 法可以選擇性的檢測(cè)凋亡細(xì)胞，而非壞死細(xì)胞或因輻照和藥物治療而造成的 DNA 鏈斷裂的細(xì)胞。標(biāo)記的dUTP（如地gao辛-dUTP、生wu素-dUTP），可以直接進(jìn)行原位檢測(cè)，是一種更快速、直接的檢測(cè)手段。

本試劑盒應(yīng)用范圍廣，可用于檢測(cè)冷凍或石蠟切片中的細(xì)胞凋亡情況，也可檢測(cè)培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的凋亡情況。可選擇性的檢測(cè)凋亡細(xì)胞，而非壞死細(xì)胞或因輻照和藥物治療而造成的DNA鏈斷裂的細(xì)胞。本試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，耗時(shí)短，只需一步染色反應(yīng)，洗滌后即可檢測(cè)。

使用方法

實(shí)驗(yàn)材料（自備）

PBS 緩沖液（pH~7.4）

0.4%Triton X-100（PBS配制）

0.1%Triton X-100（PBS配制，其中含5 mg/mLBSA）

4%多聚甲醛（PBS 配制）

免疫組化筆 

脫蠟溶劑（石蠟切片樣本）

石蠟切片處理相關(guān)試劑

抗熒光淬滅封片劑

ddH2O

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

A. 陽(yáng)性對(duì)照

DNaseI處理制備陽(yáng)性對(duì)照載玻片。DNase I可以消化單鏈或雙鏈DNA暴露3'-OH末端，人為造成細(xì)胞凋亡。每次實(shí)驗(yàn)做一次即可。（用來(lái)驗(yàn)證本次實(shí)驗(yàn)操作和試劑盒有無(wú)問(wèn)題）

B. 陰性對(duì)照

使用不含TdT Enzyme的TUNEL Reaction Buffer，用ddH2O替代TdT Enzyme。（主要是排除細(xì)胞自身凋亡、操作過(guò)程等原因?qū)е碌姆翘禺愋匀旧灰约罢{(diào)整拍攝曝光強(qiáng)度。）

C. 實(shí)驗(yàn)處理組

實(shí)驗(yàn)組按照說(shuō)明書(shū)正常操作。

D. 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組

實(shí)驗(yàn)組按照說(shuō)明書(shū)正常操作。

實(shí)驗(yàn)步驟

1、樣本準(zhǔn)備：

（1）對(duì)于貼壁細(xì)胞或細(xì)胞涂片

a. PBS清洗1次。

注：如果擔(dān)心細(xì)胞涂片的細(xì)胞貼得不牢，可以干燥樣品使細(xì)胞貼得更牢。

b. 固定：加入適量4%多聚甲醛（PBS配制），4℃固定30min。PBS清洗2次。

c. 通透：加入適量0.4%TritonX-100（PBS配制），室溫通透20min。PBS 清洗2次。

d. 轉(zhuǎn)步驟2.TUNEL反應(yīng)。

（2）對(duì)于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液

a. 收集細(xì)胞（3-5×10⁶個(gè)細(xì)胞），1000rpm離心5min，PBS清洗2次。

b. 固定：加入適量4%多聚甲醛（PBS配制）充分重懸細(xì)胞，4℃固定30 min。2000 rpm離心5min，PBS清洗2次。

c. 通透：加入適量0.4%TritonX-100（PBS配制），室溫通透20min。2000 rpm離心5min，PBS清洗2次。

d. 轉(zhuǎn)步驟2.TUNEL反應(yīng)。 

（3）石蠟組織切片

a. 將石蠟切片置于切片架上，放置于60℃烘箱中烤片60min。

b. 脫蠟與水化：將切片樣本依次放入二甲苯I（10min）→ 二甲苯II（10min）→ 100％乙醇I（5min）→ 100％乙醇II（5min）→ 95%乙醇（5min）→ 90%乙醇（5min）→ 80%乙醇（5min）→ 70%乙醇（5min）→ ddH2O沖洗5min，沖洗2次。

注：二甲苯有毒，易揮發(fā)，請(qǐng)?jiān)谕L(fēng)櫥中進(jìn)行此操作。

c. 用濾紙吸干切片樣本周圍液體，用免疫組化筆圈好樣本輪廓，以便下游通透與標(biāo)記。

注：若后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作中發(fā)現(xiàn)免疫組化筆畫(huà)的輪廓圈被破壞，需及時(shí)補(bǔ)畫(huà)。

d. 通透：按1:50的比例，將2mg/mL的Proteinase K溶液用PBS稀釋至終濃度40µg/mL，在每個(gè)樣本上滴加100µL，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，37℃孵育30min。

注：Proteinase K 可通透細(xì)胞膜和核膜，從而使后續(xù)步驟的染色試劑充分進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行反應(yīng)，提高標(biāo)記效率。孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn)，過(guò)短則可能造成透性處理不充分，影響標(biāo)記效率。為得到更好的結(jié)果，Proteinase K的濃度、孵育時(shí)間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進(jìn)行優(yōu)化。

e. 將切片樣本浸入1×PBS漂洗三次，每次5min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤(rùn)。

注：這一步必須把Proteinase K洗滌干凈，否則會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。

f. 轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL反應(yīng)。

（4）冰凍組織切片

a. 固定：取出冰凍切片，并回溫至室溫。將切片樣本浸入4%多聚甲醛（PBS配制）中，室溫固定30min。將切片樣本浸入1×PBS漂洗三次，每次10min。

注：若是擔(dān)心甲醛清洗不干凈，影響最終染色效果?？稍诩兹┕潭ㄍ瓿珊蠹尤脒m量2mg/mL甘an酸清洗10min，中和殘留的固定液，再進(jìn)行PBS清洗。

b. 用濾紙吸干切片樣本周圍液體，用免疫組化筆圈好樣本輪廓，以便下游通透與標(biāo)記。

注：若后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作中發(fā)現(xiàn)免疫組化筆畫(huà)的輪廓圈被破壞，需及時(shí)補(bǔ)畫(huà)。

c. 通透：按1:50的比例，將2mg/mL的Proteinase K溶液用PBS稀釋至終濃度40µg/mL，在每個(gè)樣本上滴加100µL，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，37℃孵育20min。

注：Proteinase K 可通透細(xì)胞膜和核膜，從而使后續(xù)步驟的染色試劑充分進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行反應(yīng)，提高標(biāo)記效率。孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn)，過(guò)短則可能造成透性處理不充分，影響標(biāo)記效率。為得到更好的結(jié)果，Proteinase K的濃度、孵育時(shí)間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進(jìn)行優(yōu)化。如優(yōu)化Proteinase K的濃度與孵育時(shí)間仍無(wú)法改善染色效果，可選擇將樣本浸入1% Triton X-100（PBS配制）中，室溫促滲3-5min；之后將切片樣本浸入1×PBS漂洗三次，每次5min。

d. 將切片樣本浸入1×PBS漂洗三次，每次5min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤(rùn)。

注：這一步必須把ProteinaseK洗滌干凈，否則會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。

e. 轉(zhuǎn)步驟2.TUNEL反應(yīng)。

（5）陽(yáng)性處理（僅陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行此步驟，其他樣品直接進(jìn)行TUNEL反應(yīng)步驟）

a. 按1:10 的比例用ddH2O將10×DNase I Buffer稀釋成1×DNase I Buffer 備用。

b. 滴加100µL 1×DNase I Buffer到已處理的樣本上，覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫平衡5min。

c. 用1×DNase I Buffer 以1:100 稀釋 DNase I (2 U/μL)至終濃度20 U/mL的工作液。

d. 棄去Buffer，加入100 μL濃度為20U/mL的DNaseI工作液，室溫孵育15min。

e. 棄去DNase I工作液，PBS清洗2次。

f. 轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL反應(yīng)。

2、TUNEL反應(yīng)

（1）配制TUNEL反應(yīng)液（即用即配）

（2）對(duì)于貼壁細(xì)胞、細(xì)胞涂片或組織切片

 a. 每個(gè)樣本加入50 μL TUNEL反應(yīng)液，使反應(yīng)液均勻覆蓋樣本。37℃避光孵育適宜的時(shí)間（細(xì)胞推薦染色時(shí)間15-30minh，組織染色時(shí)間推薦1h）。 

注：50 μL TUNEL反應(yīng)液適合涂片、切片或96孔板（其他不同孔板可以適當(dāng)調(diào)整TUNEL反應(yīng)液體積，覆蓋細(xì)胞即可）。如果待檢測(cè)的樣品為涂片、切片或在24孔板、12孔板或6孔板中，可以使用防蒸發(fā)膜，或自行嘗試使用自封袋或者其它適當(dāng)材料自行裁剪成比孔略小的圓形塑料片，滴加TUNEL反應(yīng)液后覆蓋在樣品上，可以防止TUNEL反應(yīng)液蒸發(fā)，并且使TUNEL反應(yīng)液均勻覆蓋樣本。

b. 棄去TUNEL反應(yīng)液，PBS清洗2次后，再用0.1% Triton X-100 （PBS配制，其中含5mg/mLBSA）清洗3次，每次5min，這樣游離的未反應(yīng)的標(biāo)記物可以清除較干凈。

c.（可選）每個(gè)樣本加入適量濃度為5 μg/mL的DAPI染液，室溫避光孵育5min。染色完成后，棄去DAPI染液，PBS清洗2次，每次5min。

d.（可選）切片封片：每個(gè)樣本滴加20 μL抗熒光淬滅封片劑（抗熒光淬滅封片劑可能會(huì)不適用于某些染料，實(shí)驗(yàn)前建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)試匹配性），蓋上蓋玻片，用鑷子的鈍端輕輕敲擊蓋玻片，去除氣泡以使封片wan全。

e. 用濾紙吸去多余的液體，向樣本區(qū)域加100 μL PBS保持樣本濕潤(rùn)，立即在熒光顯微鏡下觀察。

（3）對(duì)于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液

a. 每個(gè)樣本管加入50 μLTUNEL反應(yīng)液輕輕重懸細(xì)胞，37℃避光孵育15-30min。每隔10 min用微量移液器輕輕重懸細(xì)胞。

b. 2000 rpm離心5min，棄去TUNEL反應(yīng)液，用0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5mg/mL BSA）清洗2次，每次5min，這樣游離的未反應(yīng)的標(biāo)記物可以清除較干凈。

c. 每個(gè)樣本管加入100 μL濃度為5 μg/mL的DAPI染液，室溫避光孵育5min。

d. 加入400 μL PBS重懸細(xì)胞，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)或進(jìn)行涂片后在熒光顯微鏡下觀察。

注意事項(xiàng)

1. 使用前請(qǐng)將產(chǎn)品瞬時(shí)離心至管底，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2. 染色背景較重或非特異性著色明顯時(shí)可適當(dāng)減少染色時(shí)間。

3. 實(shí)驗(yàn)時(shí)建議增加陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照組。

4. 組分A使用時(shí)請(qǐng)佩戴口罩、手套，如接觸皮膚，請(qǐng)立即用大量水沖洗。

5. 熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

6. 本產(chǎn)品僅限于科研，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。 

7. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。