T7 High Yield RNA Synthesis Kit

產(chǎn)品貨號 ：T0126

儲(chǔ)存條件： -20℃ 保存，有效期2年

產(chǎn)品描述

產(chǎn)品簡介

T7 High Yield RNA Synthesis Kit是一種使用T7 RNA聚合酶，以帶有T7啟動(dòng)子的DNA為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄大量合成RNA的試劑盒，適用于長鏈和短鏈轉(zhuǎn)錄本。本品提供的T7 Enzyme Mix中已經(jīng)預(yù)混了RNase抑制劑與無機(jī)焦磷酸酶，而DNase I，RNase-free用于轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后清除模板DNA。使用本品以1μg線性化雙鏈DNA模板可以轉(zhuǎn)錄獲得至少150μg以上的RNA。通過轉(zhuǎn)錄合成的RNA可用于多種下游應(yīng)用，如體外翻譯、RNA結(jié)構(gòu)和功能研究、RNase保護(hù)、探針雜交、RNA干擾等。

轉(zhuǎn)錄方案

使用方法

1. DNA 模板制備

帶有 T7 啟動(dòng)子的線性化質(zhì)?；?PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物都可以作為體外轉(zhuǎn)錄模板，模板可以用TE緩沖液或Nuclease-Free Water溶解。

T7啟動(dòng)子序列：TAATACGACTCACTATAN*

注：N*為RNA轉(zhuǎn)錄的第一個(gè)堿基,一般為G，若進(jìn)行共轉(zhuǎn)錄由帽子類似物決定。

（1）質(zhì)粒模板

將目的DNA插入含有T7啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體中，然后用限制酶進(jìn)行處理，待完quan線性化后進(jìn)行純化。

注1：由于終止子不能保證轉(zhuǎn)錄100%終止，環(huán)狀質(zhì)粒會(huì)轉(zhuǎn)錄出不同長度的RNA產(chǎn)物。為了得到特定長度的RNA，質(zhì)粒必須完quan線性化。

注2：質(zhì)粒線性化所選限制酶的酶切位點(diǎn)需要緊鄰編碼鏈下游，且在編碼鏈中無識(shí)別位點(diǎn)。選擇的限制酶要能形成5'突出末端或者平滑末端。

注3：為了避免蛋白及鹽離子等對轉(zhuǎn)錄體系的影響，線性化質(zhì)粒建議純化后再作為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

注4：質(zhì)粒DNA抽提過程中引入的RNaseA殘留會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)錄RNA的質(zhì)量，建議使用A260/A280為1.8~2.0的高純度RNase-free模板。

（2）PCR 產(chǎn)物模板

帶 T7 啟動(dòng)子的 PCR 產(chǎn)物可以作為體外轉(zhuǎn)錄模板。首先將 T7 啟動(dòng) 子序列加在編碼鏈上游引物的 5' 端，然后在高保真酶的作用下擴(kuò)增含 T7 啟動(dòng)子的 DNA模板，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。 PCR 產(chǎn)物可以不經(jīng)純化直接作為模板， 但純化后 RNA 收率會(huì)更高。

注 1：PCR 產(chǎn)物作為模板，必須電泳確認(rèn)產(chǎn)物的特異性及濃度，建議 20 μl 反應(yīng)體系投入 2~5 μl PCR 產(chǎn)物。

注 2：為了得到更多高品質(zhì)的 RNA，推薦 PCR 產(chǎn)物純化之后再作為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

2. 體外轉(zhuǎn)錄

（1）根據(jù)所需產(chǎn)物類型選擇下面三個(gè)反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)溶液加樣。

①標(biāo)準(zhǔn)體外轉(zhuǎn)錄體系

在冰上配制如下反應(yīng)體系：

a. 建議先加入Nuclease-Free Water, 然后再加入 ATP/CTP/GTP/UTP。

b. 可以用同樣摩爾濃度的修飾 NTP 替代相應(yīng)的未修飾 NTP。

②加帽 RNA 共轉(zhuǎn)錄體系     

在冰上配制如下反應(yīng)體系：

c. 帽子類似物與每種 NTP 的摩爾濃度之比應(yīng)為 4 : 5，該摩爾比適用于 CleanCap 系列帽子類似物。若使用其它結(jié)構(gòu)的帽子類似物，請根據(jù)帽子類似物的說明書設(shè)定帽子類似物與 GTP 的合理比例，可根據(jù)加帽效率調(diào)整比例，但兩者終濃度之和控制在 10 mM 為宜。

③非放射性標(biāo)記 RNA 體外轉(zhuǎn)錄體系

d. 本體系適用生wu素修飾 UTP、熒光素修飾 UTP、地gao辛修飾 UTP 或者氨基烯丙 基修飾 UTP，使用修飾 UTP 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量會(huì)比未修飾 UTP 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量偏低。

注 1：不同模板序列的轉(zhuǎn)錄效率差異較大，初次實(shí)驗(yàn)可先按照建議加入量進(jìn)行，然 后再摸索優(yōu)化最適體系，模板量可在 0.5 μg~2 μg的范圍進(jìn)行調(diào)整。

（2）充分混勻并瞬離后，37℃溫育 2 h。若轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度 <100 nt，可 延長反應(yīng)時(shí)間至 3~16 h。

（3）反應(yīng)結(jié)束后，向產(chǎn)物中按照每 μg Template DNA 加入 2 μl DNase I, RNase-free 的比例，37℃孵育 15 min 以去除 DNA 模板。

（4）轉(zhuǎn)錄后的 RNA 推薦用磁珠或者柱純化，也可以采用酚/氯仿或者氯化鋰純化。純化后的 RNA 可以進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)或者儲(chǔ)存于 -80℃?zhèn)溆谩?/p>

3. 對照模板轉(zhuǎn)錄（T 包裝不含）

對照模板是一個(gè)含有T7啟動(dòng)子的線性 DNA 片段，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大小 約 4000 nt。在推薦的標(biāo)準(zhǔn)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，1μg 對照模板 DNA 在 37℃下反應(yīng) 2h至少可獲得150μg以上的 RNA。

4. 產(chǎn)物純化

轉(zhuǎn)錄后的 RNA 可以選用磁珠法進(jìn)行純化，也可以采用柱純化、酚 / 氯仿純化法或氯化鋰沉淀法等，以去除蛋白、游離的核苷酸。純化后的 RNA 經(jīng)電泳檢測后可進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)或存儲(chǔ)于 -80℃。

(1) 磁珠純化法

按照磁珠說明書進(jìn)行純化操作。

(2) 柱純化法

純化前加入80μl Nuclease-Free Water 將產(chǎn)物稀釋至 100 μl，再按純化柱說明書進(jìn)行純化操作。

(3) 酚 / 氯仿純化法

①向 20 μl 反應(yīng)混合物中，加入 115 μl Nuclease-Free Water 和 15 μl 3 M 乙酸鈉 (pH5.2)，混合均勻。

②加入等體積 (150 μl) 的酚 / 氯仿 (1：1) 混合液抽提一次，室溫以最大轉(zhuǎn) 速  (≥12000 rpm） 離心 5 min，將上層水相溶液轉(zhuǎn)移至新的 RNase-free EP 管中。

注：轉(zhuǎn)移上清時(shí)請勿吸到中間層。

③再加入等體積的氯仿抽提 2 次，收集上清，并轉(zhuǎn)移至新的 RNase-free EP 管中。

④加入 2 倍體積的無水乙醇沉淀 RNA。混合均勻后置于 -20℃至少 30 min，以最大轉(zhuǎn)速(≥12000 rpm），4℃離心 15 min，收集沉淀。

⑤加入 500 μl 冰預(yù)冷的 70% 乙醇洗滌 RNA 沉淀，以最大轉(zhuǎn)速  (≥12000 rpm） ， 4℃離心 5 min ，收集沉淀。

⑥用 20 μl Nuclease-Free Water溶解RNA 沉淀。純化后的 RNA 溶液于 -80℃保存。

(4) 氯化鋰沉淀法

采用氯化鋰沉淀法，RNA 長度至少滿足 100 nt 以上，且濃度不能低 于 100 ng/μl。

①向 20 μl 反應(yīng)混合物中，加入 30 μl Nuclease-Free Water 和 30 μl 7.5 M 氯化鋰。

②混合均勻后，置于 -20℃至少 30 min，以最大轉(zhuǎn)速 (≥12000 rpm），4℃ 離心 15 min，收集沉淀。

③加入 500 μl 冰預(yù)冷的 70% 乙醇洗滌 RNA 沉淀，以

最大轉(zhuǎn)速  (≥12000 rpm），4℃離心 5 min，收集沉淀。

④用 20 μl Nuclease-Free Water 溶解 RNA 沉淀。純化后的 RNA 溶液 于 -80℃保存。

5. RNA 定量

(1) 紫外吸收法：游離的 NTP 等會(huì)嚴(yán)重影響定量的準(zhǔn)確性，采用此方法 前請*行 RNA 純化。

(2) 染料法：可使用 RNA 特異熒光染料或相關(guān)試劑盒進(jìn)行 RNA 定量，可 以對純化或者未純化的反應(yīng)產(chǎn)物中的 RNA 進(jìn)行定量。

6. RNA 檢測

(1) 凝膠電泳法

為了評估轉(zhuǎn)錄本的長度及質(zhì)量，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物應(yīng)選擇合適的非變性或變 性瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳檢測。變性電泳下可減少 RNA 的 二級結(jié)構(gòu)形成 , 通常 RNA 以正確大小的單個(gè)條帶遷移。

注 1：電泳緩沖液和凝膠均需現(xiàn)配現(xiàn)用，使用尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)推薦 用 0.5× TBE（貨號：T7272）電泳緩沖液電泳。

注 2：轉(zhuǎn)錄完成的 RNA 可用 Nuclease-Free Water 稀釋后電泳，電泳上樣量推薦 0.05~1 μg。

注 3：加完 RNA Loading Bu?er 后的樣品可于 65℃處理 5~10 min 以減少RNA二級結(jié)構(gòu)形成。

注 4：可使用 Safe Red 核酸染料 ( 貨號：CR001） 觀察 RNA 電泳條帶，聚丙烯 凝膠酰胺凝膠推薦用泡染法觀察條帶。

(2) 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法可數(shù)字化的精確評估 RNA 樣本的完整性、純度或降解 程度。與凝膠法相比，此法所需 RNA 樣本量低，靈敏度高。

常見問題