酵母菌落PCR試劑盒(堿裂解法)

貨號：L7278

儲存條件：

-20oC保存，至少一年有效。

Yeast Lysis Buffer和Neutralization Buffer可以室溫或4oC保存，至少一年有效。

Yeast Colony PCR Mix (Red, 2X)盡量避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品組分：

產(chǎn)品描述

蘭博利德生產(chǎn)的酵母菌落PCR試劑盒(堿裂解法)是一種非常便捷的用于釀酒酵母、畢赤酵母等菌株在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后陽性克隆菌落的PCR篩選和鑒定的試劑盒。本試劑盒提供了Yeast Lysis Buffer用于破壞酵母細(xì)胞壁，并提供了Yeast Colony PCR Mix (Red, 2X)用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Yeast Colony PCR Mix (Red, 2X)是含有紫紅色和黃色染料(電泳位置分別約2.5kb和10bp)的2倍濃度的PCR預(yù)混液，含有2X Taq DNA Polymerase、2X PCR Buffer、2X dNTP和2X Loading Buffer等，用戶只需加入酵母菌落裂解液、引物和水即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且擴(kuò)增完畢后可以直接上樣電泳。同時提供了Yeast Lysis Buffer在PCR反應(yīng)前對酵母進(jìn)行有效預(yù)處理，可以充分釋放酵母DNA，能確保有效進(jìn)行酵母菌落PCR，從而大大縮短酵母轉(zhuǎn)化后陽性克隆鑒定的時間，提高實驗效率。

酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁主要成分為多糖(85%-90%)和蛋白質(zhì)(10%-15%)，其中多糖是由甘露聚糖、β-葡聚糖和少量的幾丁質(zhì)等組成，處于細(xì)胞壁內(nèi)層的β-葡聚糖與幾丁質(zhì)共價相連，起到細(xì)胞骨架的作用；而外層的甘露聚糖與中層蛋白質(zhì)中的絲*酸或蘇*酸以O(shè)-糖苷鍵相連接，形成的甘露糖蛋白覆蓋于細(xì)胞表面，給予酵母細(xì)胞一定的韌性。酵母細(xì)胞壁*特的結(jié)構(gòu)致使其DNA難以被簡單的PCR加熱過程所釋放，導(dǎo)致很多將酵母直接作為模板進(jìn)行PCR檢測的試劑盒成功率都比較低。

本試劑盒使用非常便捷。本試劑盒中提供的Yeast Colony PCR Mix (Red, 2X)已經(jīng)含有所有的通用組分，用戶只需自備引物和水即可對酵母菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增。它大大簡化了PCR操作，使操作更加快捷，也減少了PCR操作過程中可能導(dǎo)致的污染；同時Yeast Colony PCR Mix (Red, 2X)中已經(jīng)包含了上樣緩沖液組分，PCR擴(kuò)增結(jié)束后即可直接上樣電泳，無需添加上樣緩沖液。

本試劑盒中提供了雙色染料，便于電泳時觀察電泳進(jìn)程。本試劑盒中的Yeast Colony PCR Mix (Red, 2X)加入了紫紅色和黃色的電泳示蹤染料(整體呈現(xiàn)紅色)，其在濃度為1%瓊脂糖膠中的遷移位置分別大約位于2.5kb和10bp處。PCR結(jié)束后可直接進(jìn)行電泳檢測，無需再添加上樣緩沖液。紫紅色和黃色示蹤染料不會影響對相應(yīng)DNA條帶的觀察和檢測。

使用方法：

1. 酵母菌落的裂解

a. 準(zhǔn)備PCR管(例如蘭博利德生產(chǎn)的PCRG-1G 0.2ml優(yōu)級PCR單管 )，每管中加入10μl Yeast Lysis Buffer。

b. 用無菌吸頭挑取0.2-1mm酵母單克隆至含10μl Yeast Lysis Buffer的PCR管中，吹打混勻或Vortex混勻，低速離心數(shù)秒使液體聚集在管底。同時對于該菌落進(jìn)行標(biāo)記或同時接種該菌落到液體培養(yǎng)基或新的平板上。

注：菌體過多可能會影響Yeast Lysis Buffer對酵母的裂解并影響后續(xù)PCR反應(yīng)，菌體量通常不宜超過約2μl。

c. 在PCR儀上95oC加熱5分鐘，以充分釋放酵母的DNA。

d. 加入10μl Neutralization Buffer，混勻，后續(xù)即可作為DNA模板用于PCR檢測。

2. 酵母菌落PCR反應(yīng)體系的設(shè)置：

a. 室溫融解Yeast Colony PCR Mix (Red, 2X)，上下顛倒輕輕混勻后低速離心數(shù)秒。

b. 參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)體系：

注：通常引物的終濃度為0.2μM時可獲得良好的檢測效果，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0μM范圍內(nèi)調(diào)整引物的終濃度。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時，可降低引物濃度。超純水可以選購D0055WJ（Lablead DNase/RNase-Free, Sterile Water）。

c. 吸取步驟1d準(zhǔn)備好的DNA模板1μl至配制好的19μl PCR反應(yīng)體系中，輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫低速離心數(shù)秒，使液體聚集在管底。

d. 如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴石蠟油(M8410 Mineral oil)。

e. 把設(shè)置好的PCR反應(yīng)管置于PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。

3. PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下示例：

Step1(起始變性): 94oC 3min；Step2(變性): 94oC 30sec；Step3(退火): 55oC 30sec

Step4(延伸): 72oC 1min/kb；Step5(循環(huán)): Go To Step2 for 30 cycles；Step6(最終延伸): 72oC 10min

Step7(臨時保存): 4oC forever

注1：PCR反應(yīng)的設(shè)置需根據(jù)模板、引物、PCR產(chǎn)物的長度和GC含量等條件的不同，設(shè)定不同的PCR反應(yīng)條件包括溫度、時間和循環(huán)數(shù)等。

注2：Step4(延伸)的時間設(shè)置需根據(jù)PCR產(chǎn)物的長度進(jìn)行設(shè)置，通常每kb產(chǎn)物的延伸時間為1分鐘。例如PCR產(chǎn)物的長度為1kb，則延伸時間可以設(shè)置為1分鐘，PCR產(chǎn)物的長度為2kb，則延伸時間可以設(shè)置為2分鐘，以此類推。

注3：對于初次進(jìn)行的PCR，為盡量確?？梢詳U(kuò)增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設(shè)置為35。對于需進(jìn)行半定量或定量的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)一定要進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，使PCR反應(yīng)沒有達(dá)到平臺期。

4. 結(jié)果檢測

PCR結(jié)束后直接取5-10μl進(jìn)行電泳檢測，無需添加上樣緩沖液。

注意事項:

①酵母菌落較難裂解，裂解時請注意吹打混勻或Vortex震蕩混勻。

②由于PCR反應(yīng)非常靈敏，可使目的基因擴(kuò)增超過1000萬倍，在設(shè)置PCR反應(yīng)時請注意避免微量待擴(kuò)增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對照以確認(rèn)是否有待擴(kuò)增DNA的污染。

③避免反復(fù)凍融本產(chǎn)品，多次反復(fù)凍融可能使產(chǎn)品性能下降。

④使用本產(chǎn)品前，一定要完*融化，并上下顛倒輕輕混勻后才能使用，并盡量避免產(chǎn)生氣泡。

⑤超純水推薦選購D0055WJ（Lablead DNase/RNase-Free, Sterile Water）。

⑥本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

⑦為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。