DNA Assembly Mix PLUS KIT產(chǎn)品貨號：D0204P

儲存條件：-20℃

產(chǎn)品組分：

DNA Assembly Mix PLUS產(chǎn)品簡介：

基于重組原理的無縫克隆技術(shù)，作為新一代的克隆方法，不依賴繁瑣的酶切、連接步驟，也不需要末端補(bǔ)平等操作，依據(jù)DNA片段與線性化載體末端的15~25nt同源序列的重組，可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點(diǎn)，載體自連背景極低，是一種簡單、快速、高效的DNA定向克隆技術(shù)。

DNA Assembly MixPLUS無縫克隆試劑盒最快僅需5分鐘即可完成單片段重組，且陽性率高于95%。Mix中添加的輔助因子，有效提高克隆陽性率；經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)體系，能夠一定程度上耐受未純化PCR產(chǎn)物中含有的雜質(zhì)。升級版的無縫克隆試劑盒具有更高的陽性率、更好的兼容性。

使用簡單 —— 兼容PCR與酶切體系，省去繁瑣的純化步驟

超高效率 —— 可以穩(wěn)定支持5-6片段在同一克隆體系

穩(wěn)定可靠 —— 37℃放置一周或凍融30次，無明顯下降

實(shí)驗(yàn)步驟：

1、實(shí)驗(yàn)流程概要

2、線性化克隆載體制備

選擇合適的克隆位點(diǎn)，對載體進(jìn)行線性化，載體的線性化可以通過酶切或反向 PCR 擴(kuò)增完成。

① 酶切制備

推薦使用LabFD™快速內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，使載體線性化wan 全，以降低轉(zhuǎn)化背景(假陽性克隆)；若使用單酶切進(jìn)行線性化，可以適當(dāng)延長酶切時(shí)間以減少環(huán)狀質(zhì)粒殘留。

注1：經(jīng)雙酶切進(jìn)行線性化的載體無需去磷酸化，經(jīng)單酶切則需要去磷酸化；

注2：酶切完成后，應(yīng)將快速內(nèi)切酶失活或?qū)δ康漠a(chǎn)物純化后再用于重組反應(yīng)。

② 反向 PCR 擴(kuò)增制備

為減少擴(kuò)增突變的引入，推薦使用高保真PCR Mix進(jìn)行擴(kuò)增。推薦使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為模板，以減少環(huán)狀質(zhì)粒模板殘留對克隆陽性率的影響。

3、插入片段PCR引物設(shè)計(jì)

PCR引物的5' 端必須包含與其相鄰片段（插入片段或載體）末端同源的15~25 nt（推薦18nt）序列。假如載體為粘性末端，且3'端突出，則引物設(shè)計(jì)必須包含突出部分；若5'端突出，則引物設(shè)計(jì)可以包含突出部分，也可以不包含。

插入片段正向擴(kuò)增引物：

5'—上游載體末端同源序列+酶切位點(diǎn)（可選）+ 基因特異性正向擴(kuò)增序列— 3'

插入片段反向擴(kuò)增引物：

3'—基因特異性反向擴(kuò)增序列+酶切位點(diǎn)（可選）+下游載體末端同源序列—5'

注1：盡量選擇無重復(fù)序列且GC含量均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆，當(dāng)載體克隆位點(diǎn)上下游25 nt區(qū)域內(nèi)GC含量為40%~60%時(shí)，重組效率zui高；

注2：本試劑盒所提供的 pUC 19 載體（Ampr）連接端序列如下：

4、插入片段的 PCR 擴(kuò)增

推薦使用高保真PCR Mix進(jìn)行擴(kuò)增，以減少擴(kuò)增突變的引入。建議使用純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行無縫克隆反應(yīng)，若PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，可直接使用，但加樣體積不應(yīng)超過總反應(yīng)體積的20%。

5、重組反應(yīng)

①于冰水浴中配置以下反應(yīng)體系：

a.最適載體用量(ng)=0.02×載體堿基對數(shù)，即0.03pmol。

b.插入單片段，最適片段用量（ng）= 0.04×片段堿基對數(shù)；

插入多片段，每片段zui適用量（ng）= 0.02×片段堿基對數(shù)。

注1：若插入單片段的長度大于載體，則應(yīng)互換載體與插入片段用量；

注2：若插入片段的長度小于200 bp，則插入片段應(yīng)使用5倍載體用量；

注3：若按上述公式計(jì)算得到的用量超過zui低/zui高值，則建議直接按zui低/最高用量使用；

注4：載體片段過長、插入片段過長克隆陽性率均會降低。

重組反應(yīng)體系配制完成后，用移液槍輕輕吸打混勻各組分，避免產(chǎn)生氣泡，切勿渦旋。

② 將反應(yīng)體系置于50℃，反應(yīng)5~60min。

注1：推薦使用 PCR 儀等溫控比較精準(zhǔn)的儀器進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間不足或太長克隆效率均會降低；

注2：插入1-2個(gè)片段時(shí)，推薦反應(yīng)時(shí)間5-15min，插入3-5個(gè)片段時(shí)，推薦反應(yīng)時(shí)間15-30min；

注3：當(dāng)載體骨架在 10 kb 以上或插入片段在4 kb以上時(shí)，建議延長反應(yīng)時(shí)間到30-60min

注4：50℃反應(yīng)完成后，建議進(jìn)行瞬時(shí)離心，將反應(yīng)液收集至管底。

③ 將反應(yīng)液離心管置于冰上冷卻，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)化或者儲存于-20℃。

注1：-20℃儲存的重組產(chǎn)物，建議在1周內(nèi)使用。

6、重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

取5~10μl反應(yīng)液，加入到100 μl感受態(tài)細(xì)胞中緩慢吸打混勻，冰上放置30min。42℃熱激45~60sec，冰浴5 min。加500 μl SOC或LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)40~60min（200 rpm）。將菌液均勻涂布在含有對應(yīng)抗生素的平板上，倒置于37℃過夜培養(yǎng)。

注1：不同感受態(tài)細(xì)胞最后的克隆陽性率會有所差別，推薦使用轉(zhuǎn)化效率>108 CFU/μg的感受態(tài)細(xì)胞；

注2：菌落數(shù)取決于PCR產(chǎn)物與線性化載體的數(shù)量和純度；

注3：陽性對照平板通常生長大量白色單菌落，陰性對照平板只生長很少的菌落。

7、陽性克隆檢測

挑取單菌落至10 μl ddH2O中混勻，95℃裂解10 min 后，取1 μl裂解液作為模板，進(jìn)行菌落PCR鑒定，或?qū)尉浣臃N至抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。

注1：菌落 PCR 時(shí)建議至少使用一條通用引物，避免假陽性結(jié)果；

注2：必要時(shí)可進(jìn)一步對陽性結(jié)果進(jìn)行測序鑒定。

常見問題：