NcoI 快速內(nèi)切酶

產(chǎn)品貨號(hào)：F5550S

儲(chǔ)存條件：-20℃                                            

同裂酶：Bsp19I

注：同裂酶對(duì)于不同的甲基化修飾可能具有不同敏感性。

產(chǎn)品組成

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

LabFD™快速內(nèi)切酶是一系列經(jīng)過(guò)基因工程重組、能夠在5~15分鐘內(nèi)精確完成DNA切割的高保真限制性內(nèi)切酶，適用于質(zhì)粒DNA、PCR產(chǎn)物或基因組DNA等的快速酶切。LabFD™快速內(nèi)切酶具有如下特點(diǎn)：5~15分鐘內(nèi)即可完成酶切；共用一種酶切Buffer，大大簡(jiǎn)化酶切反應(yīng)體系；良好的酶活冗余度，輕松應(yīng)對(duì)底物過(guò)量或困難模板酶切。此外，LABLEAD去磷酸化、連接試劑在LabFD™酶切Buffer中具有100%活性，支持一管化反應(yīng)，提升“酶切-修飾-連接"的體驗(yàn)。

建議反應(yīng)條件

1×LabFD™緩沖液；

37℃溫育；

參照“DNA快速酶切流程"配制反應(yīng)體系。

失活條件

80℃溫育 20 min。

質(zhì)量控制

功能活性檢測(cè)

最適反應(yīng)溫度下，在20ul反應(yīng)體系中，1ul LabFD™ NcoI能夠在15min內(nèi)wanquan消化1ugλDNA。

超長(zhǎng)時(shí)間溫育檢測(cè)

最適反應(yīng)溫度下，將1ul LabFD™  NcoI與1ugλDNA共同溫育3h，未檢測(cè)到其他核酸酶污染或星號(hào)活性引起的底物非特異性降解，延時(shí)酶切可能出現(xiàn)星號(hào)活性。

酶切-連接-再酶切檢測(cè)

最適反應(yīng)溫度下，使用1ul LabFD™  NcoI消化底物，回收酶切產(chǎn)物。在22℃下使用適量Fast T4 DNA Ligase可以將酶切產(chǎn)物重新連接。將連接產(chǎn)物再次回收后，使用相同的內(nèi)切酶可以重新切開(kāi)連接產(chǎn)物。

非特異性內(nèi)切酶活性檢測(cè)

最適反應(yīng)溫度下，將1ul LabFD™  NcoI與1ug超螺旋質(zhì)粒DNA共同溫育4h，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，質(zhì)粒DNA仍然處于超螺旋狀態(tài)。

藍(lán)白斑檢測(cè)

將含有單一lacZα基因的載體以1ul LabFD™  NcoI消化，重新連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有對(duì)應(yīng)抗生素、IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基平板上。連接正確的產(chǎn)物會(huì)生長(zhǎng)出藍(lán)色菌落，而連接錯(cuò)誤（即DNA末端切口不完整）的產(chǎn)物將得到白色菌落。對(duì)于LabFD™系列限制酶而言，白色菌落比例應(yīng)小于1%。

使用方法

1.DNA快速酶切流程

1）在冰上按如下建議的加樣順序配制反應(yīng)體系：

注：本體系適用于經(jīng)過(guò)純化的PCR產(chǎn)物酶切，未純化的PCR具備一定的離子強(qiáng)度，10xLabFD^TMbuffer加入量可適當(dāng)減少至2ul。但由于DNA聚合酶同時(shí)具有外切酶活性，會(huì)影響酶切產(chǎn)物，因此如下一步需進(jìn)行克隆等操作，建議酶切前對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

2）輕柔吸打或輕彈管壁以混勻（切勿渦旋），然后瞬時(shí)離心以收集掛壁液滴；

3）37℃溫育15min（質(zhì)粒），或15~30min（PCR產(chǎn)物），或30~60min（基因組DNA）；

4）80℃溫育 20 min即可使酶失活，停止反應(yīng)。

2.雙酶切或多酶切

1）每種快速內(nèi)切酶的用量為1ul，并根據(jù)需要適當(dāng)擴(kuò)大反應(yīng)體系；

2）所有快速內(nèi)切酶的體積總和不得超過(guò)總反應(yīng)體系的1/10；

3）如果所用的幾種快速內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同，應(yīng)先以最適溫度低的酶開(kāi)始酶切，再添加最適溫度較高的酶，在其最適反應(yīng)溫度下進(jìn)行酶切反應(yīng)。

3.適用于質(zhì)粒的擴(kuò)大反應(yīng)體系

注：如果總反應(yīng)體系大于20ul，應(yīng)適當(dāng)增加溫育時(shí)間，盡量使用水浴、金屬浴或沙浴。

不同DNA中的酶切位點(diǎn)數(shù)量

甲基化修飾影響

在不同反應(yīng)緩沖液中的活性

注：活性數(shù)據(jù)來(lái)自LABLEAD限制酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系下的檢測(cè)。